【中英文題目】
小麥抗赤霉病基因Fhb1基因，編碼帶有凝集素結構域以及類毒素成孔結構域的嵌合凝集素
Wheat Fhb1?encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight
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【基本信息】
期刊：NATURE GENETICS
年份：2016
IF: 32.197
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【摘要】
小麥赤霉病(FHB)是由鐮刀菌引起的，對麥類作物的破壞性極強，造成糧食嚴重減產，食用患病小麥的人畜會產生不良反應。隨著FHB在美國、加拿大、歐亞以及南非的相繼爆發，FHB已經成為全球關注的話題。在1993-2001年的美國，由于FHB造成的經濟損失大約70.67億美元。大量研究表明，Fhb1基因是抗FHB的數量性狀位點(QTL)，文章報道了關于中國小麥栽培種Fhb1基因的圖位克隆技術。通過進行變異分析、基因沉默以及轉基因表達，發現Fhb1基因含有類毒素成孔結構域(PFT)，具有抗赤霉病的作用，推測PFT編碼含有兩個凝集素結構域和一個ETX/MTX2毒素結構域的嵌合凝集素。
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【研究思路】
取材：
取抗性和易感近同源系(R-NIL 260-1-1-2和S-NIL 260-1-1-4)用于本次基因表達研究
取Kansas State University的41個地方種和栽培種的種子用于本次研究關聯分析
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文庫構建及測序策略：
基于Sumai 3（蘇麥3號，含有Fhb1基因位點的中國栽培種）構建BAC庫，基因覆蓋度~3×，插入序列的平均長度~100 kb
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信息分析：
【研究結果】
1、對抗FHB的基因的進一步確定
Fhb1基因來自中國栽培種Sumai 3，是重要的QTL位點，文章報道了Fhb1基因的定位克隆，之前已經有研究將Fhb1基因的范圍縮小到0.08cM，兩側的DNA標記分別為STS3B-355和STS3B-334，本研究利用了同樣的標記物，其他標記物來自CS（普通小麥中國春）?3BS，根據BAC末端標記篩選Sumai 3 BAC文庫。
文章通過指紋法組裝了8個重疊的BACs，并對4個BACs(476D8, 71I24, 383G12以及572D13)進行測序，在Fhb1附近形成兩個contigs(一共~350 kb)，之后進一步組裝注釋。如圖1，對Sumai 3的13個基因進行了注釋。將Sumai 3的Fhb1區域與CS的3B和3D染色體的同源區域進行比較，發現Sumai 3的Fhb1區域在基因成分和長度上與3D染色體更為相似。
圖1 ?Fhb1對應表型以及map過程 ?(a)抗性和易感的近同源系(NILs)的穗表現出不同的FHB表型。相比R-NIL（抗性）的穗，S-NIL（易感）的穗發生嚴重褪色；(b) S-NIL的被鐮刀霉損壞的干癟的谷粒與R-NIL飽滿健康的谷粒的比較；(c) Sumai 3中Fhb1基因在染色體上的定位；(d)染色體上經3B 355和3B 334標記的0.08cm區間展現出Fhb1基因的染色體圖譜；(e) Sumai 3中Fhb1基因的物理圖譜，包括13個開放讀碼框（箭頭表示）及其對應位置。橙色線條表示不含基因的重復區域，將編碼蛋白的基因分別進行標記：MT表示tRNA甲基化轉移酶；PG表示果膠酶；NAD表示結合NAD的氧化轉移酶；NBA含有Nb-ARC結構域；TS表示類合成酶；His表示富含組氨酸的鈣結合蛋白；HC表示類HCBT的防御應答蛋白；PFT表示成孔類毒素；Sin表示sina超家族；SG表示SGNH植物酶；Cys表示胱抑素；FB含有F-box結構域；帶星號的基因排除在Fhb1候選基因以外。(f)與CS 3DS的同源區域的比較；(g) 與CS 3BS的同源區域的比較。‘ζ’和‘ψ’分別表示基因片段和假基因；ψUDG表示假基因UDP-葡萄糖 6-脫氫酶。
為了確定抗FHB的基因，文章利用實時定量PCR對麥穗中的注釋基因進行表達分析，對于抗性近等位基因系(R-NIL)和易感近等位基因系(S-NIL)分別注入鐮刀霉和水。PFT基因和含Nb-ARC結構域的基因(NBA)只在R-NIL中表達，而其他基因在兩種NIL中均表達。此外，通過基因互補，將13個基因中的6個排除在外（圖1e），剩下的7個基因中，PFT基因和NBA基因是已知的在植物抗性中可能發揮主要作用的基因，因此，文章針對這兩個候選基因做了進一步的基因結構和蛋白質序列的預測。
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2、PFT基因的結構及突變分析
PFT基因全長3472bp，含有兩個外顯子，最終產生1437bp的mRNA，cDNA末端(RACE)的隨機擴增表明PFT轉錄本含有一個49bp的5’UTR區和216bp的3’UTR區（圖2a）；預測蛋白含有478個氨基酸，并包含了兩個凝集素結構域和一個ETX/MTX2結構域（圖2b）；此外，文章中利用針對誘導基因組局部病變(TILLING)的方法來確定PFT的候選基因。從1929個M2家系中篩選出30個突變體，突變體pft1284, pft1958,?pft1409,?pft1700以及?pft528在純合子狀態下致使作物易感FHB（圖2a），另外，圖2c可以看到，易感突變體在被感染后麥穗發生嚴重脫色，但是，HR58親本的麥穗則是健康的。除此之外，這些突變體還含有很高的脫氧雪腐鐮孢烯醇(DOH)，麥穗也表現出很高比例的枯萎褪色，麥粒干癟缺水（圖2d）；
圖2 PFT的基因結構和突變分析??(a)PFT基因含有兩個外顯子（橙色框）通過一個內含子（黑色線條）相連，兩頭的綠色框表示的是非編碼區，箭頭表示易感TILLING突變；(b)PFT蛋白保守結構域的分析顯示含有兩個凝集素超家族結構域和一個ETX/MTX2超家族結構域，灰色框利用數字標志了氨基酸的位置；(c)易感的TILLING突變突變體被FHB感染后表現出嚴重的褪色現象，白色箭頭指向的是接種位點；(d)突變體的鐮刀霉感染的谷粒與健康的抗性HR58親本的谷粒的比較。
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3、RNAi誘導基因沉默來驗證PFT基因的功能
RNAi可以誘導基因沉默，文章對小麥栽培種Bobwhite中的PFT基因做RNA干擾，該品種適合進行轉化但是不含有Fhb1（圖3a），而含有Fhb1的Sumai 3和R-NIL則不適用于組織培養，因此不適合進行轉化。圖3b可以看到，R-NIL和Bobwhite（未轉化）雜交得到的F1代植株可以抗FHB病；定量PCR結果表明，PFT的表達在R-NIL-RNAi F1代植株的麥穗中的表達比R-NIL-Bobwhite植株至少減少150倍（圖3e），Fhb1抗性株往往攜帶有PFT基因。
圖3 RNAi誘導基因沉默來驗證PFT基因的功能??(a)用于轉化實驗的PTF基因經過自補RNAi構建的結構示意圖；(b)經RNAi誘導以及鐮刀霉交叉感染的發白的麥穗與未進行RNAi的綠色的麥穗的比較示意圖，F1 R-NIL與RNAi Bobwhite雜交后麥穗嚴重褪色，易感Bobwhite和RNAi Bobwhite雜交結果也是如此，但是R-NIL與未進行RNAi的親本雜交得到的卻是綠色的麥穗（中間），圖中黑色的點就是感染位點；(c) 經RNAi誘導以及鐮刀霉交叉感染的發白的麥粒與未進行RNAi的綠色的麥粒的比較示意圖，F1 R-NIL與RNAi Bobwhite雜交后麥粒干癟發白，但是R-NIL與未進行RNAi的親本雜交得到的卻是健康的種子；(d)反轉錄PCR發現只在轉基因系中進行RNAi（第一個膠）；PFT基因在非轉基因對照組中表達，但是在RNAi系中表達受到抑制（第二個膠）；肌動蛋白則證明mRNA在所有樣本中均有表達（最后一個膠）；(e)對F1植株開花前期的麥穗做定量PCR發現相比未進行RNAi的樣本，進行RNAi的樣本至少減少了150倍。
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【研究結論】
文章通過進行變異分析、基因沉默以及轉基因表達，發現Fhb1基因含有類毒素成孔結構域(PFT)，具有抗赤霉病的作用，推測PFT編碼含有兩個凝集素結構域和一個ETX/MTX2毒素結構域的嵌合凝集素。
Fhb1的序列信息有利于在標記輔助育種中涉及更好的標記物，為FHB疾病多基因聚合和基因工程提供長遠經濟的解決思路。